Парадокс Левинталя

2.2.2. Парадокс Левинталя

Как белок ухитряется найти свою нативную структуру среди астрономического числа возможных за те немногие секунды, что отпущены на его сворачивание? А число это огромно приблизительно $10^{100}$ возможных конформаций для цепи из 100 остатков; их тупой перебор занял бы приблизительно $10^{80}$ лет (если считать, что переход из одной конформации в другую занимал бы $10^{-13}$ сек.). А достаточно полный перебор конформаций может быть только тупым – ведь белок может почувствовать стабильность конформации, только попав прямо в нее, т.к. отклонение даже на 1 Å может очень сильно повысить энергию цепи в плотной белковой глобуле.

По-видимому, самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному “пути сворачивания”, и та структура, где этот путь заканчивается, и является его нативной структурой, вне зависимости от того, есть ли еще более стабильная укладка цепи, или нет. Иными словами, нативная структура белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, т.е. она соответствует не глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи.

Сложность проблемы заключается в том, что поднятый вопрос нельзя решить чисто экспериментально. Действительно: предположим, у белковой цепи есть другая “ненативная”, но еще более стабильная укладка. Как ее найти если сам белок ее не находит? Ждать результата в течение приблизительно $10^{80}$ лет?

С другой стороны, действительно ли существует противоречие между “структурой стабильности” и “структурой быстро сворачивающейся”? Может быть, стабильная структура автоматически является фокусом “быстрых” путей сворачивания, и поэтому автоматически обладает свойством сворачиваться быстро?

Чтобы в этом разобраться, вначале рассмотрим следующие термодинамические факты:

1. Разворачивание белка обратимо, причем оно происходит как переход “все-или-ничего”. Это означает, что в точке денатурации белка только две формы белковой молекулы – “нативная” и “денатурированная” – присутствует в заметных количествах, а все прочие (“полусвернутые” или “неверно свернутые”) практически отсутствуют. Такой переход возможен только в цепях, аминокислотная последовательность которых обеспечивает достаточно большую энергетическую щель между основной массой структур и самой стабильной структурой цепи;
2. Денатурированная форма белков (во всяком случае, небольших белков, развернутых сильным и концентрированным денатурантом) – часто является неупорядоченным клубком;
3. В нормальных физиологических условиях нативная форма белка лишь немногим стабильнее его денатурированной формы (а в средней точке перехода обе эти формы имеют, естественно, одинаковую стабильность). При этом нативная структура белка стабильна благодаря своей низкой энергии, т.е. благодаря своей высокой конформационной энтропии, т.е. благодаря огромному числу разных развернутых конформаций.

Итак, чтобы разрешить “парадокс Левинталя” и показать, что самую стабильную структуру белковой цепи можно найти за разумное время, мы можем, в первом приближении, рассматривать только скорость перехода “все-или-ничего” из клубка в самую стабильную структуру цепи, причем нам достаточно рассмотреть случай, когда самая стабильная укладка цепи лишь чуть-чуть более стабильна, чем клубок, а все прочие формы белковой цепи термодинамически нестабильны. Кроме того, здесь не нужно рассматривать влияние стабильных интермедиаторов сворачивания, т.к. они появляются лишь тогда, когда нативная структура становится много стабильнее клубка. При этом сворачивание белка достигает максимальной скорости, но его анализ усложняется. Поэтому мы ограничимся окрестностью точки равновесия нативной структуры с клубком, где белок сворачивается пусть не максимально быстро, но максимально просто. Причем мы должны рассматривать только такие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают наличие большой “щели” между энергией самой стабильной структуры цепи и энергиями всех прочих ее укладок.

При таких условиях самая стабильная структура небольшого белка или домена автоматически становится центром “быстрых” путей сворачивания и потому должна сворачиваться за биологически разумное время: секунды или минуты.

Чтобы путь был быстр, каждый шаг на этом пути должен проходить быстро, таких шагов должно быть не слишком много, и главное – этот путь не должен преграждаться барьером в виде очень высокой свободной энергии на одной из стадий сворачивания.

Так как время фиксации одного звена мало ( примерно 1-10 нс, судя по измеренной скорости роста α-спиралей в белковых цепях), то белок, фиксируя одно свое звено за другим, сворачивался бы мгновенно (100-звенная цепь за 100-1000 нс), если бы при этом он не должен был преодолевать свободно-энергетический барьер.

Итак: главный вопрос – высок ли барьер на пути, ведущему к самому стабильному состоянию белковой цепи? Сворачивание белковой цепи ведет к падению ее энтропии (из-за роста упорядоченности цепи) и энергии (из-за образования контактов между сближающимися звеньями цепи). Падение энтропии повышает, а падение энергии понижает свободную энергию цепи. Если, по ходу сворачивания, цепь должна очень близко подойти к своей финальной структуре перед тем, как начнут возникать стабилизирующие эту структуру контакты (т.е. цепь должна потерять почти всю свою энтропию перед тем как начнет выигрываться энергия), то повышение свободной энергии на первом этапе сворачивания будет пропорциональным числу звеньев в цепи, т.е. очень большим, а сворачивание цепи – страшно медленным (согласно химической кинетике, время протекания процесса экспоненциально зависит от достигаемого по его ходу максимального повышения свободной энергии). Именно такая картина (проигрыш всей энтропии до начала выигрыша энергии) лежит в основе “парадокса Левинталя”, утверждающего, что белковая цепь никак не может, даже за время жизни Вселенной, найти свою самую стабильную структуру.

Напротив, если путь сворачивания таков, что по ходу его падение энтропии практически тут же компенсируется падением энергии, то он не перекрыт высоким свободно-энергетическим барьером, и сворачивание идет быстро.

---

Один из возможных путей последовательного сворачивания белка. Штриховой линией показана цепь, остающаяся в неупорядоченном состоянии – клубке. Выделенная точками область соответствует уже обретшей свою финальную конформацию части белковой глобулы. Жирной линией выделена главная цепь уже свернувшейся глобулы. На каждом шаге этого пути одно звено цепи извлекается из клубка и занимает то положение, в котором оно будет находится в финальной (самой стабильной) структуре глобулы.

По мере роста куска финальной глобулы при ее последовательном сворачивании, в ней одно за другим восстанавливаются взаимодействия, стабилизирующие финальную структуру. Если растущая структура все время остается более или менее компактной, то число этих взаимодействий будет расти (а их энергия, соответственно, будет падать) почти пропорционально числу фиксируемых в глобуле звеньев.

Правда, в начале сворачивания падение энергии несколько замедленно, т.к. прилипание звена к поверхности маленькой глобулы дает, в среднем, меньше контактов, чем прилипание к поверхности большой. В результате, возникает нелинейный поверхностный (т.е. пропорциональный $n^{2/3}$ ) член в энергии ΔE растущей глобулы. Таким образом, максимальное отклонение от линейного падения энергии составляет величину порядка $N^{2/3}$ , где N - число звеньев в белковой цепи. Это отклонение, мало по сравнению с полным падением энергии при сворачивании цепи, которое составляет величину порядка Nε , где ε - среднее изменение энергии остатка при его переходе из клубка в нативную глобулу.

Во-вторых, по ходу роста глобулы падает энтропия цепи – примерно пропорционально числу фиксированных в глобуле звеньев. Правда, в начале сворачивания энтропия может падать несколько быстрее из-за образования замкнутых петель, свободно торчащих из растущей глобулы. В результате, возникает нелинейный поверхностный член в энтропии ΔS этой растущей глобулы, составляющий (также, как поверхностный член в ΔE ) величину порядка $N^{2/3}$ , что существенно меньше, чем само падение энтропии, составляющие (как и падение энергии) величину порядка N .

Входящие в энтропию ΔS и энергию ΔE линейные и нелинейные члены входят в свободную энергию ΔF = ΔE - TΔS растущей глобулы. Когда мы рассматриваем условия, в которых финальная глобула находится в термодинамическом равновесии с клубком, то большие линейные члены взаимно аннигилируют. В самой точке равновесия ΔF = 0 и в клубке (т.е. при n = 0 ), и в финальной глобуле (т.е. при n = N ). Значит, рост энтропии и падение энергии при последовательном сворачивании компенсируют друг друга в главном (линейном по длине свернутой цепи n ) члене, и не будь поверхностных эффектов, ΔF было бы нулем на всем рассматриваемом пути сворачивания.

Следовательно, свободно-энергетический барьер связан только с относительно малыми нелинейными поверхностными эффектами. Значит, высота барьера на любом пути последовательного сворачивания пропорциональна не числу звеньев N (как то, фактически, полагал Левинталь), а всего лишь $N^{2/3}$ .

В результате время достижения самой стабильной структуры растет с числом звеньев цепи N не “по Левинталю”, т.е. не как $10^{N}$ и вообще не как экспонента от N , а всего лишь как $exp(\lambda N^{2/3})$ ( λ = 1 ± 0.5 , причем конкретная величина λ зависит как от формы укладки цепи в глобулу (от того, много или мало неупорядоченных петель торчит из нативоподобного ядрышка), так и от распределения сильно и слабо притягивающихся аминокислотных остатков в ней (от того, сгруппированы ли в ядрышке сильно притягивающиеся остатки)).

Поэтому, наблюдаемые времена сворачивания (перехода клубок → нативная глобула, в точке термодинамического равновесия этих двух состояний) лежат в диапазоне от 10 нс × $exp[0.5N^{2/3}]$ до 10 нс × $exp[1.5N^{2/3}]$ .

Причина того, что самая стабильная структура белка достигается всего за время ≈ exp[1 ± 0.5 $N^{2/3}$] наносекунд, - в том, что падение энтропии по ходу последовательного сворачивания тут же (с точностью до поверхностных эффектов) компенсируется энергией возникающих взаимодействий.

Глобулярный зародыш белковой структуры не перестраивается по ходу сворачивания (на что потребовалось бы гигантское время), а все перестройки происходят только в рыхлом клубке (и потому быстро).

Цепь из 100-150 аминокислотных остатков должна находить свою самую стабильную структуру за секунды или минуты. Это объясняет также, почему большие белки состоят из отдельно сворачивающихся стабильных доменов, иначе их сворачивание было бы слишком медленным.

Найдя максимум свободной энергии на пути сворачивания, можно найти ту точку пути, которой он соответствует, т.е. оценить размер ядра сворачивания белковой структуры. Расчет показывает, что это ядро довольно велико, оно охватывает около половины белковой глобулы. Столь большой размер ядра показывает, что белок не может сворачиваться по многим параллельным путям, - путям с принципиально разными переходными состояниями (и ядрами). Следовательно, мы не сделали большой погрешности, рассматривая только один из возможных путей сворачивания.

До сих пор мы рассматривали сворачивание белковой цепи вблизи точки фазового перехода, когда только одна (нативная) ее структура сравнима по стабильности с клубком, а все прочие нестабильны.

Что произойдет со скоростью самоорганизации цепи при удалении от точки фазового перехода? Нас интересует случай, когда стабильность нативной структуры растет (когда стабильность падает, эта структура просто не образуется). Рост стабильности нативной глобулы (например, при понижении температуры или при разбавлении раствора денатуранта водой) приводит сперва к увеличению скорости достижения нативной структуры, т.к. свободная энергия интермедиатов ее сворачивания падает, а конкурирующие с нативной структурой укладки цепи все еще остаются из-за “энергетической щели” – нестабильными (а). Такое ускорение наблюдается до определенного предела. Максимальная скорость сворачивания должна достигаться, когда конкурирующие с нативной структурой “неправильные” компактные укладки цепи (а их стабильность тоже растет при понижении температуры и разбавлении денатурата) как раз сравниваются по стабильности с клубком. При дальнейшем росте стабильности глобул идет быстрое сворачивание многих “неправильных” структур с их последующим медленным частичным разворачиванием и переходом в нативную структуру (b).

a. Самая стабильная структура цепи N стабильнее клубка U, а все конкурирующие с ней структуры M в сумме менее стабильны, чем клубок. Идет быстрое и безошибочное сворачивание самой стабильной структуры; пути сворачивания “неверных” структур M практически не обследуются молекулой, т.к. на них свободная энергия только возрастает;

b. Помимо структуры N, многие свернутые структуры M более стабильны, чем клубок U. Идет быстрое сворачивание многих “неправильных” структур с их последующим, очень медленным частичным разворачивание и переходом в нативную структуру N.

Что будет, если у цепи не одна структура отделена от прочих большой энергитической щелью, а, скажем две? Если обе эти структуры стабильны по сравнению с клубком, первой из них свернется та, к которой ведет лучший (с немного более низким барьером) путь сворачивания. Однако, если эта структура хоть немного менее стабильна, чем другая, последует очень медленный (т.к. по пути придется разворачивать метастабильную структуру) переход в наиболее стабильную форму. Таких “полиморфных” белков должно быть мало, т.к. аминокислотные последовательности, кодирующие одну выделенную стабильную укладку цепи – редки, а кодирующие сразу две такие укладки – редки в квадрате.

Однако, некоторые белки, серпины (ингибиторы сериновых протеаз), и, возможно, прионы (они вызывают “бешенство коров”) ведут себя именно так. В последнем случае полиморфизм осложнен агрегацией (слипанием), которой способствует “новая” β-структурная форма белка. При агрегации растет эффективная длина цепи фолдона (т.е. домена) N , что делает возникновение новой фазы очень медленным. Но зато раз возникший зародыш новой формы агрегированного белка втягивает в агрегат и переводит в эту новую форму все остальные белковые молекулы. Эта же агрегация прионов в клетках мозга приводит в конце концов к летальному исходу при “коровьем бешенстве”, почесухе и родственным болезням с огромным инкубационным периодом. К таким болезням, судя по всему, относится и старческий маразм.

В заключение обратимся еще раз к энергетическому ландшафту белковой цепи и посмотрим, как самая стабильная структура автоматически пролагает к себе быстрые, преодолевающие парадокс Левинталя, пути сворачивания.

Через очень холмистый ландшафт (“холмы” соответствуют мощному, но короткодействующему отталкиванию при столкновении кусков цепи) от каждого энергетического минимума широко расходится “воронка”, или, точнее, сеть более или менее гладких “дорожек”. Эти дорожки соответствуют разным путям последовательного сворачивания структуры. На всех этих путях не происходит перестройки уже свернувшейся части глобулы, и потому на них нет больших ухабов (а маленькие – не помеха, если температура не слишком низка). Двигаясь по этим дорожкам к энергетическому минимуму, молекула выигрывает энергию, но, одновременно, фиксируя свою укладку, теряет энтропию. Чем глубже энергетический минимум – тем круче ведущие к нему дорожки, тем легче преодолевать, идя по ним, “энтропийное сопротивление”, возникающие при фиксации укладки скатывающейся в энергетический минимум цепи. Сила этого сопротивления, поскольку оно энтропийное, пропорционально температуре. При очень высокой температуре оно выталкивает цепь из всех энергетических минимумов, так что цепь не сворачивается вообще. При очень низкой температуре энтропийное сопротивление мало – цепь скатывается в любой ближайший минимум, и никак не может дойти до глобального энергетического минимума. И, наконец, при оптимальной для сворачивания температуре энтропийное сопротивление преодолевается на путях только к одному, самому глубокому минимуму – куда цепь и попадает достаточно быстро.

Все изложенные соображения о компенсации энергией энтропии по пути самоорганизации и о том, что это решает парадокс Левинталя, применимы и к образованию нативной структуры белка не только из клубка, но и по другим сценариям – из расплавленной глобулы или через напоминающие их интермедиаты. Внешне совсем разные сценарии экспериментального поведения сворачивающегося белка возникают из-за того, что различные взаимодействия дают разный вклад в общую свободную энергию молекулы при разных условиях.